також від нагрівання і дії сонячного проміння.
Емульсію антигену зберігають у холодильнику при 4 град. С не
більше тижня, а з додаванням розчину мертиолату - протягом 2-х
тижнів. У день постановки реакції потрібну для даного робочого дня
кількість емульсії беруть з холодильника залишають для зігрівання
при кімнатній температурі на 30 хв. і перевіряють її придатність
на контрольних сироватках крові. Емульсію, яку використовують,
необхідно захищати від світла, загорнувши пробірки з нею чорним
папером. Придатність кожної нової серії антигену перевіряють
експрес-методом одночасно зі старою серією на явно позитивних і
слабопозитивних сироватках крові. Про придатність антигену судять
по величині титрів, які спостерігають під час одночасного
титрування позитивних сироваток крові з новою і старою серіями
антигенів. Одержання близьких результатів - тобто величин титрів
реагентів, які відрізняються на +- 1 розведення, однакового
виявлення пластівців преципітації, які спостерігають в одних і тих
самих розведеннях позитивних сироваток крові, слабо позитивних, а
також відсутність преципітації у негативній сироватці крові
свідчіть про придатність серії антигена, яку досліджують. Серію
антигена бракують, якщо одночасно титрування контрольної
позитивної сироватки з новою серією антигена показує: а)
слабовиявлений преципітат (2+, 1+) при мінімальних розведеннях
сироватки крові;
б) більш низький (на 2-3-и розведення) титр преципітатів, ніж
зі старої серії;
в) наявність преципітату у негативних сироватках крові.
ОДЕРЖАННЯ ПЛАЗМИ КРОВІ. Кров беруть з пальця так само, як для
дослідження швидкості осаду еритроцитів (ВІОЕ). Під час взяття
крові змочують капіляр апарату Панченкова 5% розчином цитрату
натрію, набравши розчину до помітки "0", повертають до флакону
розчин до помітки "25", а цитрат натрію, що залишився, виливають
до центрифужної або вассерманівської пробірки, куди потім вносять
три капіляри крові, взятої до помітки "0", змішують. Кров
відстоюють при кімнатній температурі, а в зкстренних випадках
центрифугують з метою одержання плазми крові (експрес-метод), яку
відсмоктують пастерівською піпеткою для проведення дослідження.
ОДЕРЖАННЯ ІНАКТИВОВАНОЇ СИРОВАТКИ КРОВІ. Кров беруть з вени,
одержують сироватку крові і інактивують її так само, як і для РЗК.
МЕТОДИКА
ПОСТАНОВКИ МІКРОРЕАКЦІЇ 3 ПЛАЗМОЮ І ІНАКТИВОВАНОЮ
СИРОВАТКОЮ КРОВІ
Пастерівською піпеткою насмоктують плазму або інактивовану
сироватку крові і вносять по три краплі у лунки, куди потім
додають одну краплю емульсії кардіоліпінового антигена. До кожної
лунки вносять плазму або інактивовану сироватку крові від одного
обстежуваного і нумерують її згідно зі списком у реєстраційному
журналі. Інгредієнти змішують струшуванням пластинки протягом 5
хвилин, потім до кожної лунки додають по три краплі ізотонічного
розчину натрію хлориду, змішують погойдуванням пластинки і
залишають при кімнатній температурі на 5 хвилин (оптимальний
температурний режим реакції 23-28 град. С). Результати враховують
лише після з'явлення пластівців у контрольній слабопозитивній
сироватці крові, але не пізніше 7-10 хвилин від з'єднання
інгредієнтів.
ОБЛІК РЕЗУЛЬТАТІВ РЕАКЦІЙ. Результати лічать неозброєним оком
і над штучним джерелом освітлення. У лунках з плазмою і
сироваткою крові, які взяли від хворих на сифіліс, осідають різні
за розмірами пластівці. Появу великих пластівців розцінюють як
позитивний результат (4+, 3+), середньої величини і дрібних - як
слабопозитивний (2+, 1+).
При негативному результаті пластівці не утворюються. У
сумнівному випадку необхідно орієнтуватися на контроль негативної
сироватки крові. Якщо в ньому пластівці відсутні, а у зразках
плазми або сироватки крові осіб, яких обстежують утворюються
дрібні пластівці, результат в цьому випадку вважають сумнівним.
КІЛЬКІСНИЙ МЕТОД МІКРОРЕАКЦІЇ
Кількісний метод мікрореакції дає змогу, не подовжуючи часу
постановки реакції (15-30 хв.), об'єктивніше оцінити стан
обстежуваних (рівень антитіл преципітантів) і використати його як
критерій оцінки у динаміці лікування хворих на сифіліс.
Розведення сироватки або плазми одержують таким чином: в усі
лунки плексигласової пластини розливають апаратом Флоринського по
0,15 мл (3-й краплі по 0.05 мл) сироватки або плазми. Змішують
вміст лунки першого ряду і переносять апаратом Флоринського (можна
і піпеткою з балончика) до наступного ряду лунок, потім змішують
вміст другого ряду і переносять до 3-го ряду. Таким чином,
переносять суміш ізотонічного розчину хлориду натрію і сироватки
(плазми) до 4-го, 5-го, 6-го ряду лунок пластини. З останнього
ряду лунок виливають по 0,15 мл і одержують розведення сироватки
або плазми 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64. Реакцію вираховують по
випаденню преципітату. Титром сироватки або плазми вважають те
розведення, яке дає результат на 2+.
Обстеження хворих на сифіліс та осіб з псевдохибнопозитивними
серореакціями паралельно РЗК і РМП з кардіоліпіновим антигеном
показало, що певному титру РЗК відповідає певний титр РМП при
використанні у реакції плазми або сироватці.
Так, під час дослідження сироватки крові титру РЗК 1:5
відповідає титр РМП 1:4 (від 2 до 4), титру РЗК 1:10 (від 2 до 8),
титру РЗК 1:20-титр РМП 1:6 (від 2 до 4-8), титру РЗК 1:40 - титр
РМП 1:8 (від 4 до 16), титру 1:80 - титр РМП 1:12 (від 8 до
16-32), титру РЗК 1::1б0 - титр РМП 1:18 (від 8 до 32), титру РЗК
1:320 - титр РМП 1:28 (від 16 до 32-64), титру РЗК 1:640 - титр
РМП 1:44 (від 16-й до 64).
Слід відзначити більш високі титри РМП з плазмою, ніж з
сироваткою крові.
Як у хворих на сифіліс, так і у осіб з хибнопозитивними
серореакціями крові, зі збільшенням титру РЗК, відповідно,
збільшується і титр РМП.
У хворих на первинний серопозитивний сифіліс позитивна
мікрореакція передує РЗК, яка стає позитивною лише з початком
лікування, а у хворих на сифіліс після лікування вона нерідко
залишається позитивною у титрі від 2 до 4, протягом 2-3 місяців і
після негативації РЗК. Мають місце випадки, коли якісна РМП була
негативною у хворих на сифіліс при позитивній РЗК у титрі 1:80 і
вище, а при кількісній постановці РМП вона була позитивною у тирі
від 2 до 4 і вище. Це можна пояснити тим, Що при надто великих
титрах преципітинів комплекс антиген-антитіло не утворився,
оскільки було мало антигену на цю кількість антитіл. Показання для
постановки кількісної РМП.
1. На прийомі у лікаря для встановлення титру РМП і
відповідно приблизного тиру РЗК.
2. У динаміці для оцінки якості лікування хворих на сифіліс,
що проводиться.
3. У тих випадках, коли РЗК неможливо поставити з технічних
причин (відсутність електроенергії, реактивів).
КОМПЛЕКС СТАНДАРТНИХ СЕРОЛОГІЧНИХ РЕАКЦІЙ
(РЕАКЦІЯ ЗВТЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ (РЕАКЦІЯ ВАССЕРМАНА)
Для виконання реакції зв'язування комплементу необхідні такі
інгредієнти:
ДОСЛІДЖУВАНА СИРОВАТКА
Взяття крові проводять натщесерце або не раніше 6 годин після
прийому їжі. Не можна брати кров у хворих з підвищеною
температурою, після вживання спиртних напоїв раніше 24 годин, у
тих, що нещодавно перенесли інфекційне захворювання, у жінок під
час менструації, вагітних у останні 10 днів вагітності, породіль у
перші 10 днів після пологів, новонароджених у перші 10 днів життя.
Кров з ліктьової вени у кількості 8-10 мл беруть у суху чисту
пробірку. Пункцію проводять стерильною голкою, дотримуючись правил
асептики. У грудних дітей кров беруть з надрізу вузьким скальпелем
п'ятки.
До лабораторії кров має бути доставлена не пізніше 24 годин з
моменту взяття при умові її зберігання у холодильнику при
температурі 4 град. С.
Доставлену до лабораторії кров одразу після взяття вміщують у
термостат на 15-30 хвилин при температурі 37 град. С. Згусток, що
утворився, відділяють скляною паличкою від стінок пробірки і
центрифугують 15 хвилин при 1000 об/хв. Над згустком утворюється
прозора сироватка, яку за допомогою піпетки з гумовим балоном без
домішки еритроцитів переносять у іншу пробірку. При наявності у
сироватці крові домішки еритроцитів її центрифугують і зливають.
Кров, доставлена до лабораторії напередодні постановки
реакції, обводять скляною паличкою і ставлять у холодильник при
температурі 4 град. С. Перед постановкою реакції сироватку, що
утворилася над згустком крові, переносять до іншої пробірки.
Сироватка не повинна бути використана для постановки реакції у
день взяття крові, лише через 24 години.
Зняту зі згустку сироватку інактивують у сухоповітряному
інактиваторі або водяній бані протягом 30 хвилин при температурі
56 град. С для знищення природного комплементу і стабілізації
глобулінових фракцій досліджуваної сироватки крові.
Інактивовані сироватки можуть зберігатися у морозилці
холодильника протягом 5-6 днів. Сироватки, інактивовані
напередодні, в день поставки реакції повинні бути повторно
прогріті протягом 15 хвилин при температурі 56 град. С. Активні
сироватки можуть зберігатися у морозилці холодильника протягом
1-го місяця (не допускаючи розморожування).
АНТИГЕНИ
Реакція Вассермана повинна ставитися з двома антигенами:
ультразвуковим трепонемним і кардіоліпіновим.
Ультразвуковий трепонемний антиген готують з культур блідих
трепонем, вирощених у пробірці, підданих дії ультразвуку.
Ультразвуковий трепонемний антиген випускають ліофільно
висушеним у флаконі по 5-10 мл: зберігають його у холодильнику
при температурі 4 град С.
Строк придатності антигену вказано на етикетці. Антиген
розчинюють і розводять ізотонічним розчином натрію хлориду
відповідно об'єму і титру, вказаному на етикетці флакона.
Попередньо перед розведенням по титру необхідно збовтати завись
протягом 30 хвилин. Цим досягають усунення парадоксальних
результатів.
Кардіоліпіновий антиген для реакції Вассермана є очищеним від
баластових сумішей спиртовий екстракт ліпідів з мускулів бичачого
серця. Активність антигену обумовлена присутністю трьох
компонентів - фосфоліпіду, лецетину і холестерину.
Кардіоліпіновий антиген випускають у ампулах по 2-а мл;
зберігають його у темному місці при температурі не нижче 15-18
град С. Строк придатності антигену вказано на етикетці.
Перед вживанням антиген з ампули переносять у суху чисту
пробірку, щільно закривають корковою або притертою скляною
пробкою.
В разі випадання кристалів холестерину, антиген необхідно
прогріти на водяній бані при температурі 56 град. С або у
термостаті при температурі 37 град. С до повного розчину
кристалів.
Для постановки реакції антиген розводять відповідно титру,
указаному на етикетці ампули. Розведений антиген має бути злегка
опалесцюючим, але не каламутним.
Титр - це кількість чистого антигену в 1-ому мл розчину.
Наприклад, якщо титр ультразвукового трепонемного антигену 0,05,
то для приготування 10 мл розведеного по титру антигену потрібно
взяти 0.5 мл антигену і 9,5 мл ізотонічного розчину натрію
хлориду.
Подвійні дози антигенів не повинні володіти гемотоксичністю
(гемоліз у відсутності комплементу), що установлюють відповідним
контролем антигену при титруванні комплементу. Антигени не повинні
бути антикомплементарними (придушення гемолізу), що також
установлюють при паралельному титруванні комплементу без антигенів
і в присутності антигенів, які застосовують у реакції зв'язування
комплементу.
Розведені по титру антигени вводять у реакцію в кількості
0,5 мл під час роботи в об'ємі 1,25 мл.
ГЕМОЛІТИЧНА СИРОВАТКИ (ГЕМОЛІЗИН)
Ця сироватка кролика або осла, імунізована еритроцитами
барана.
Гемолітичну сироватку (рідна або суха) випускають в ампулах
по 1 мл, вказуючи титр. Для розчинення сухого гемолізину в ампулу
додають 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Гемолітичну
сироватку як суху, так і розчинену зберігають у холодильнику при
температурі 4 град. С. Строк придатності сухої гемолітичної
сироватки вказано на етикетці.
Титр гемолітичної сироватки, яку застосовують для реакції, не
повинен бути нижче 1:1200. Визначення титру проводять за такою
схемою: готують основне розведення (0,1 мл гемолітичної сироватки
+ 9,9 мл ізотонічного розчину натрію хлориду), з якого роблять
відповідні розведення (табл. N 1).
Таблиця N 1
СХЕМИ РОЗВЕДЕНЬ ГЕМОЛІЗИНУ
------------------------------------------------------------------
|N про-|Гемолізин |Ізотонічний розчин|Розведення гемолізину|
|бірки | |натрію хлориду | |
|------+----------------+------------------+---------------------|
|I |0,1 (не |9,9 |1:100 |
| |розведений) | | |
|------+----------------+------------------+---------------------|
|II |0,5 1-го |4,5 |1:1000 |
| |розведення | | |
|------+----------------+------------------+---------------------|
|III |0,5 -"- |5,5 |1:1200 |
|------+----------------+------------------+---------------------|
|IV |0,5 -"- |7,0 |1:1500 |
|------+----------------+------------------+---------------------|
|У |0,5 -"- |8,5 |1:1800 |
|------+----------------+------------------+---------------------|
|VI |0.5 -"- |10,0 |1:2100 |
|------+----------------+------------------+---------------------|
|VII |0,5 -"- |11,5 |1:2400 |
|------+----------------+------------------+---------------------|
|VIII |0,5 -"- |13,0 |1:2700 |
|------+----------------+------------------+---------------------|
|IX |0,5 -"- |14,5 |1:3000 |
|------+----------------+------------------+---------------------|
|Х |0,5 -"- |22,0 |1:4000 |
------------------------------------------------------------------
Потім у ряд інших пробірок відмірюють по 0,5 мл раніше
приготовлених розведень гемолітичної сироватки, починаючи з
1:1000, додають по 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду і
0,5 мл комплементу (комплемент у розведенні 1:10), а також 0.5 мл
3 % суспензії еритроцитів барана (табл. N 2), пробірки ставлять у
термостат лри температурі 37 град. С на 1-у годину, періодично
струшуючи.
Таблиця N 2
ВИЗНАЧЕННЯ ТИТРУ ГЕМОЛІЗИНУ
------------------------------------------------------------------
|N |Розведе-|Гемолі-|Ізото-|Компле- |3 % зависі |Резуль- |
|пробі- |ння |зин у |нічний|мент 10%|еритроцитів |тат |
|рок |гемолі- |відп. |розчин|(мл) |барана з | |
|відпо- |зину |розве- |хлори-| |щільного осаду| |
|відно | |деннях |ду | | | |
|т. N 1 | | |натрію| | | |
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|1 |1:1000 |0,5 |1,0 |0,5 |0,5 |Гемоліз |
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|2 |1:1200 |0,5 |1,0 |0,5 |0,5 |-"- |
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|3 |1:1500 |0,5 |1,0 |0,5 |0,5 |-"- |
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|4 |1:1800 |0,5 |1,0 |0,5 |0,5 |-"- |
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|5 |1:2100 |0,5 |1,0 |0,5 |0,5 |-"- |
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|6 |1:2400 |0,5 |1,0 |0,5 |0,5 |-"- |
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|7 |1:2700 |0,5 |1,0 |0,5 |0,5 |-"- |
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|8 |1:3000 |0,5 |1,0 |0,5 |0,5 |-"- |
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|9 |1:4000 |0,5 |1.0 |0,5 |0,5 |-"- |
|----------------------------------------------------------------|
| Контролі |
|----------------------------------------------------------------|
|10 |1:1000 |0,5 |1,5 |- |0,5 |Затримка|
| | | | | | |гемолізу|
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|11 |1:1000 |- |1,5 |0,5 |0,5 |-"- |
|-------+--------+-------+------+--------+--------------+--------|
|12 |1:1000 |- |2,0 |- |0,5 |-"- |
------------------------------------------------------------------
Титром гемолітичної сироватки є найвище її розведення, що
дало повний розчин 5 мл, 3% зависі еритроцитів барана у
присутності комплементу. В даному випадку титр гемолітичної
сироватки 1:1 (табл. N 2).
Для основного досліду І титрації інгредієнтів беруть
розведення, підсилене проти одержаного титру втричі (потрійний
титр). У даному прикладі 1:500 (0,1 на 50).
ЕРИТРОЦИТИ БАРАНА
Кров беруть у барана шляхом пункції яремної вени не частіше
1-го разу за 10 днів, у кількості не більше 200 мл. Баран має
бути у віці від 1-го до 5-ти років. Кров беруть у стерильну банку
зі скляним намистом, яку струшують протягом 5-10 хв., потім кров
фільтрують через подвійний шар марлі (відокремлюють згустки ниток
фібріну, що утворилися).
Перед постановкою реакції еритроцити барана триразове
відмивають ізотонічним розчином натрію хлориду шляхом
центрифугування. Центрифугують 10 хв. при 1,5 тис. об/хв. Остання
порція промивної рідини повинна бути безбарвною, надосадову
рідину зливають; при наявності гемолізу еритроцити барана
непридатні до вживання.
З щільного осаду еритроцитів готують 3 %, завись еритроцитів
у ізотонічному розчину натрію хлориду (на 3 мл щільного осаду
еритроцитів додають 97 мл ізотонічного розчину натрію хлориду).
Дефібриновану кров зберігають протягом 5-7 днів у
холодильнику при температурі +4, +8 град. С.
Нерозведена дефібринована не відмита кров барана зберігається
довше, ніж відмиті еритроцити.
Для збереження на значно довші строки рекомендують
консервувати дефібриновану кров барана по методу Мигуліної. До 100
мл дефібринованої крові барана додають 15 мл суміші, приготованої
за таким прописом: глюкози - 6,0 г, борної кислоти - 4,5 г. 100 мл
ізотонічного розчину натрій хлориду; приготовлену суміш кип'ятять
на водяній бані 3-й дні підряд по 20 хв. Консервована кров барана
по методу Мигуліної придатна для використання протягом 3-4 тижнів.
Перед постановкою реакції при використанні консервованої крові
еритроцити необхідно відмивати ізотонічним розчином натрію
хлориду.
КОМПЛЕМЕНТ
Застосовують суміш сироваток крові, одержаної пункцією серця
у 5-10 здорових морських свинок. Кров для кращого зсідання
ставлять у термостат при температурі 37 град. С на 30 хв. Після
утворення згустка, останній відділяють від стінок пробірки, яку
вміщують у холодильник при температурі 4 град. С до наступного
дня. Одержану прозору сироватку зливають і використовують як
комплемент. Активність цього комплементу при зберіганні у
холодильнику при температурі 4 град.С не змінюється протягом 1-2
діб.
Під час консервування сухої борної кислоти і сірчанокислотним
натрієм комплемент зберігається у холодильнику при температурі 4
град. С 1-2 місяці (4,0 борної кислоти +5,0 г сірчанокислотного
натрію на 100 мл комплементу).
Може бути використаний ліофільно висушений комплемент. Сухий
комплемент випускають у ампулах по 1 мл. Розчинення сухого
комплементу проводять у день постановки реакції ізотонічним
розчином натрій хлориду при легкому струшуванні. В ампулу з сухим
комплементом додають 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду.
Потрібна для постановки реакції кількість комплементу змішують з
кількох ампул єдиної серії.
Безпосередньо перед постановкою реакції Вассермана проводять
титрування комплементу в присутності всіх інгредієнтів, що беруть
участь у досліді.
Комплемент титрують обов'язково: а) у чистому вигляді (без
антигенів), тобто у присутності лише гемолітичної системи і б) з
усіма антигенами, що входять у дослід. Титрування комплементу
проводять також у присутності інактивованої негативної сироватки
крові людини.
При титруванні комплементу інгредієнти розводять у такому
порядку:
1. Розводять гемолітичну сироватку по потроєному титру в
ізотонічному розчині натрію хлориду.
2. З щільного осаду еритроцитів готують 3% завись в
ізотонічному розчині натрію хлориду.
3. Розливають 3% завись еритроцитів барана та ізотонічній
розчин натрію хлориду в 5 контрольних пробірок і розведену по
потроєному титру гемолітичну сироватку (в другий контроль) табл.
N 3.
4. Готують гемолітичну систему: розчин гемолітичної
сироватки, розведений і по потроєному титру, приливають до рівного
об'єму 3 % зависі еритроцитів барана і швидко перемішують,
переливаючи з однієї колби в іншу.
5. Розводять антигени ізотонічним розчином натрі хлориду по
вказаному на етикетці титру.
6. Розводять свідомо негативну інактивовану сироватку крові
людини в співвідношенні 1:5 (2 мл сироватки + 8 мл ізотонічного
розчину натрію хлориду).
7. Розводять комплемент 1:10 (1 мл комплементу + 9 мл
ізотнічного розчину натрію хлориду.
Таблиця N 3
СХЕМА ПРОВЕДЕННЯ КОНТРОЛЮ
-----------------------------------------------------------------
|Інгредієнти/мл |Контрольні пробірки |
| |--------------------------|
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
|------------------------------------+----+----+----+----+------|
|Гемолітична сироватка розведення по | | | | | |
|потроєному титру | | | | | |
|------------------------------------+----+----+----+----+------|
|3 % завись еритроцитів барана з | | | | | |
|щільного осаду | | | | | |
|------------------------------------+----+----+----+----+------|
|Комплемент 1:10 | | | | | |
|------------------------------------+----+----+----+----+------|
|Ізотонічний розчин натрію хлориду | | | | | |
|------------------------------------+----+----+----+----+------|
|Антиген трепонемний, розведений по | | | | | |
|титру | | | | | |
|------------------------------------+----+----+----+----+------|
|Антиген кардіоліпіновий, розведений | | | | | |
|по титру | | | | | |
|---------------------------------------------------------------|
|Ставлять у термостат при температурі 37 град. С на 45 хвилин |
|---------------------------------------------------------------|
|Результат | | | | | |
|---------------------------------------------------------------|
|Після 45 хвилин перебування у термостаті при температурі 37 |
|град. С у всіх контрольних пробірках має бути відсутній гемоліз|
-----------------------------------------------------------------
ТИТРУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ В ОБ'ЄМІ 1,25 МЛ
Титрування комплементу проводять в 33 пробірках, поставлених
по 11 шт. у три ряди. Два ряди пробірок для титрування комплементу
в присутності двох антигенів і третій ряд - для титрування
комплементу без антигенів "per se". П'ять контрольних пробірок:
дві для контролю антигенів і по одній - для контролю комплементу,
гемолітичної сироватки і ізотонічного розчину натрію хлориду на
гемотоксичність заповнюють до об'єднання розчин гемолітичної
сироватки і зависі еритроцитів барана (табл. N 3).
Комплемент розведений 1:10, розливають у 10 пробірок першого
ряду в дозах (0,1; 0,16; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44; 0,5;
0,56; 0,6. Загальний обсяг вмісту пробірок доводять до 1-го мл
відповідними об'ємами ізотонічного розчину натрію хлориду: 0,9;
0,84; 0,8; 0,76; 0,7; 0,64; 0,6; 0,56; 0,5; 0,44; 0,4. Одержану в
кожній пробірці суміш старанно перемішують і переносять по 0,25 мл
а два рада пробірок, що стоять позаду. Потім в усі 33 пробірки
розливають по 0,25 мл інактивованої негативної сироватки крові
людини, розведеної ізотонічним розчином натрію хлориду 1:5. Далі в
11 пробірок першого ряду приливають по 0,25 мл розведеного по
титру трепонемного антигену; розведений по титру кардіоліпіновий
антиген приливають по 0,2 мл в 11 пробірок другого ряду;
ізотонічний розчин натрію хлориду приливають по 0,25 мл в 11
пробірок третього ряду.
Штатив пробірок струшують і додають по 0,5 мл гемолітичної
системи в третій рад пробірок (без антигена), штатив з пробірками
знову струшують і ставлять на 45 хвилин у термостат при
температурі 37 град. С. Після інкубації в термостаті в 22
пробірках першого і другого рядів добавляють по 0,5 мл
гемолітичної системи. Зміст пробірок знову струшують і ставлять у
термостат при температурі 37 град. С на 45 хвилин. Як мине 45
хвилин, визначають робочу дозу комплементу в присутності
антигенів, до якого роблять надбавку в межах 15-30% (в середньому
20 %) в залежності від проходження гемолізу. Враховують також титр
комплементу без антигенів "per se".
Титром комплементу є його найменша кількість, що сприяє
повному гемолізу еритроцитів барана в присутності антигену і
негативної сироватки людини.
У даному випадку титр комплементу буде 0,3, а робоча доза
комплементу - 0,36, тобто 3,6 % (табл. N 4).
МЕТОДИКА
постановки реакції Вассермана
Принцип реакції: реагіни, що є у сироватці крові хворих на
сифіліс, мають властивість вступати в з'єднання з кардіоліпіновим
антигеном. Специфічні антитрепонемні антитіла вступають в
з'єднання з специфічними антигенами (ультразвуковий трепонемний
антиген).
Комплекси, що утворилися, сорбують комплемент, який вводять у
реакцію. Індикація комплексів, що утворилися, досягається
введенням гемолітичної системи гемолітична сироватка + еритроцити
барана).
Таблиця N 4
ТИТРУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ В ПРИСУТНОСТІ АНТИГЕНУ
І НЕГАТИВНОЇ СИРОВАТКИ КРОВІ ЛЮДИНИ
--------------------------------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти (мл) | NN пробірок |
|(загальний об'єм 1,25 мл) |------------------------------------------------------|
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
|-----------------------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----|
|Комплемент 1:10 |0.1 |0.16|0.2 |0.24|0.3 |0.36|0.4 |0.44|0.5 |0.56|0.6 |
|-----------------------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----|
|Ізотонічний розчин натрію хлориду |0.9 |0.84|0.8 |0.76|0.7 |0.64|0.6 |0.56|0.5 |0.44|0.4 |
|------------------------------------------------------------------------------------------|
| Після старанного змішування з кожної пробірки переносять по 0.25 мл у |
| пробірки другого, третього ряду, що відповідно стоять позад і виливають |
|------------------------------------------------------------------------------------------|
|Негативна інактивована сироватка |по 0.25 в усі 33 пробірки |
|крові людини 1:5 | |
|-----------------------------------+------------------------------------------------------|
|Антиген трепонемний, розведений |0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|
|по титру |----+----+----+-----------------------------+----+----|
| | | | |перший ряд пробірок | | |
|-----------------------------------+----+----+----+-----------------------------+----+----|
|Антиген кардіоліпіновий, розведений|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|
|по титру |----+----+----+-----------------------------+----+----|
| | | | |другий ряд пробірок | | |
|-----------------------------------+----+----+----+-----------------------------+----+----|
|Ізотонічний розчин натрію хлориду |0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|
| |----+----+----+-----------------------------+----+----|
| | | | |третій ряд пробірок | | |
|-----------------------------------+----+----+----+-----------------------------+----+----|
|Гемолітична система |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |
| |------------------------------------------------------|
| |Струсити, помістити в термостат при 37 град. на 45 хв.|
|-----------------------------------+------------------------------------------------------|
|Гемолітична система |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |
| |------------------------------------------------------|
| | (перший і другий ряди) |
| |Струсити, помістити в термостат при 37 град. на 45 хв.|
|-----------------------------------+------------------------------------------------------|
|Результат |-Г |-Г |-Г |-Г |+Г |+Г |+Г |+Г |+Г |+Г |+Г |
--------------------------------------------------------------------------------------------
Примітка: -Г - затримка гемолізу, +Г - гемоліз.
ЯКІСНА РЕАКЦІЯ. У день постановки досліду проводять
підготовчу роботу (зливання досліджуваних сироваток крові, її
згусток, інактивація їх, відмивання еритроцитів барана від плазми,
приготування ізотонічного розчину натрію хлориду).
Розводять інгредієнти: гемолітичну сироватку, еритроцити
барана, антигени по титру, проводять титрування комплементу без
антигенів для визначення його робочої дози.
ВИТРАТИ ІНГРЕДІЄНТІВ НА 100 ДОСЛІДЖЕНЬ
Хлорид натрію х/ч (NaCl)............................ 18 г
Кардіоліпіновий антиген (РЗК)....................... 0,1 мл
Ультразвуковий трепонемний антиген.................. 2,0 мл
Комплемент.......................................... 4,5 мл
Гемолітична сироватка............................... 0,3 мл
Еритроцити барана з щільного осаду.................. 3,5 мл
Якісну реакцію (табл. N 5) для кожної досліджуваної сироватки
крові проводять у трьох пробірках з двома антигенами. Водночас
ставлять для контролю свідомо позитивну і слабопозитивну (4+, 2+)
і негативну сироватку крові. Ковну досліджувану інактивовану
сироватку крові, розведену 1:5 ізотонічним розчином натрій
хлориду, розливають по 0,25 мл у три пробірки, з яких третя е
контролем. До першої пробірки додають 0,25 мл трепонемного
антигену, до другої - кардіоліпінового антигену, розведених по
титру. До третьої (контрольної) - 0,25 мл ізотонічного розчину
натрію хлориду. Комплемент, розведений по робочій дозі, додають по
0,25 мл в усі дослідні і контрольні пробірки. Попереднє змішування
антигену і комплементу не рекомендують. Після первинної
45-хвилинної інкубації у термостаті при температурі 37 град. С
додають в усі пробірки по 0,5 мл гемолітичної системи. Легким
струшуванням змішують зміст пробірок і ставлять їх у термостат при
температурі 37 град. С на 45-60 хвилин до настання гемолізу в
контрольній пробірці. Реєструють результат реакції з антигенами
гемолізу при наступі гемолізу в дослідних пробірках.
Таблиця N 5
СХЕМА ПОСТАНОВКИ ЯКІСНОЇ РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА
------------------------------------------------------------------
|ІНГРЕДІЕНТИ |NN пробірок |
| |------------------------|
| | 1 | 2 | 3 |
| | | |(контр.)|
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
| 1 | 2 | 3 | 4 |
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
|Досліджувана інактивована сироватка, | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
|розведена 1:5 | | | |
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
|Антиген трепонемний, розведений по | 0.25 | - | - |
|титру | | | |
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
|Антиген кардіоліпіновий, розведений | - | 0.25 | - |
|по титру | | | |
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
|Ізотонічний розчин натрію хлориду | - | - | 0.25 |
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
|Комплемент, розведений за робочою дозою| 0.25 | 0.25 | 0.25 |
|----------------------------------------------------------------|
|Струсити, поставити на 45 хвилин у термостат при температурі |
| 37 град. С |
|----------------------------------------------------------------|
|Гемолітична система | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
|----------------------------------------------------------------|
|Струсити, поставити на 45-60 хвилин у термостат при температурі |
| 37 град. С (до настання гемолізу в контрольній пробірці) |
------------------------------------------------------------------
ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Результати реакції Вассермана оцінюють таким чином: повна або
значна затримка гемолізу - +4, +3 позитивна реакція); часткова
затримка гемолізу - +2 (слабопозитивна реакція); незначна затримка
гемолізу - +1 - сумнівна реакція - -1, повний гемоліз - негативна
реакція.
Оцінку результатів реєструють у книзі протоколів лабораторії
хрестами, а результати видають словами - позитивний,
слабопозитивний, сумнівний, негативний. Результат реакції слід
давати по кожному антигену окремо. У випадку розходження
результатів між антигенами необхідно проаналізувати правильність
постановки реакції. При затримці гемолізу в контролі сироватки
(третя пробірка, що не містить антигену), необхідне повторне
дослідження з сироваткою, взятою з дотриманням правил забору
крові, і при наступному антикомплементарному результаті (затримці
гемолізу в контролі) необхідне розтитрування по схемі.
Правильність протікання досліду оцінюють на основі результатів
досліджуваних контролів:
а) контролю кожної сироватки крові - третій ряд пробірок
(наявність гемолізу);
б) контролі досліду: свідомо негативної сироватки крові
(гемоліз в усіх трьох пробірках); свідомо слабопозитивної
сироватки (часткова затримка гемолізу [2+] в двох пробірках з
антигенами і гемоліз у третій контрольній пробірці без антигена);
свідомо позитивної сироватки - затримка гемолізу в двох пробірках
з антигенами і гемоліз у третій пробірці (без антигенів).
ДЖЕРЕЛА ПОМИЛОК
Невірно вибрана доза комплементу (надлишок або нестача у
досліді).
Неправильне зберігання досліджуваної сироватки крові.
Тривале зберігання досліджуваної сироватки крові.
Зберігання крові більше 24 годин на згусток.
КІЛЬКІСНИЙ МЕТОД РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА
Кожна сироватка, що дала затримку гемолізу на 4+, 3+ з
кардіоліпіновим антигеном, в тій самій постановці досліду повинна
бути досліджена кількісним методом (дослідження кількостей
сироватки, що зменшується, при розведенні ізотонічним розчином
хлориду натрію) для визначення титру реагинів (від 1:5, 1:10,
1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640).
Кожну сироватку крові досліджують у 8 пробірках. У першу
пробірку наливають 0,8 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, з
другої по восьму пробірку - по 0,25 мл ізотонічного розчину натрію
хлориду. До першої пробірки вносять 0,2 мл досліджуваної сироватки
крові, вміст змішують, потім 0,25 мл забирають, а по 0,25 мл з
переносять до другої і восьмої пробірок. Після змішування
переносять 0,25 мл з другої пробірки у третю, з третьої у четверту
і т.д. до сьомої пробірки, з якої 0,25 мл розведеної сироватки
крові вилучають. Потім приливають по 0,25 мл кардіоліпінового
антигену, розведеного по титру з першої по сьому пробірки. Після
легкого струшування в усі пробірки приливають по 0,25 мл
комплементу, розведеного за робочою дозою. Первинна інкубація у
термостаті при температурі 37 град. С триває 45 хвилин, після чого
до всіх пробірок приливають по 0,5 мл гемолітичної системи.
Струсивши пробірки, їх вміщують у термостат при температурі 37
град. С на 45-60 хвилин і після настання гемолізу у восьмій
(контрольній) пробірці реєструють результати реакції.
ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ. Титром реагинів досліджуваної сироватки є
розведення, яке дало повну затримку гемолізу -+4 або значну
затримку гемолізу - +3.
В аналізах, які видає лабораторія, при наявності позитивної
реакції вказують, з яким титром досліджуваної сироватки одержано
позитивну реакцію. Наприклад: 1:10 - 4+, 1:20 - 4+, 1:40 - 4+,
1:80 - 4/3+, 1:160 - 2+ - відповідь сироватка позитивна у титрі
1:80.
Таблиця N 6
СХЕМА ПОСТАНОВКИ КІЛЬКІСНОГО МЕТОДУ РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА
----------------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти |NN пробірок |
|(в мл) |----------------------------------------------|
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
|---------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+----|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
|---------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+----|
|Ізотонічний розчин натрію | 0.8 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25|
|хлориду | | | | | | | | |
|---------------------------+-----+----------------------------------------|
|Досліджувана інактивована |0.2 |Після змішування з 1-ї пробірки 0.25 мл |
|сироватка крові | |вилучають, а 2 і 8 пробірок переносять |
| | |по 0.25 мл. З другої пробірки після |
| | |змішування переносять послідовно з |
| | |пробірки у пробірку (з 2 в 3, з 3 в 4 і |
| | |т.д. до 7 пробірки включно) по 0.25 мл. |
| | |Одежують розведення сироватки: 1:5, 1:10|
| | |1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320. |
|---------------------------+-----+----------------------------------------|
|Антиген, розведений по |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25|
|титру (кардіоліпіновий) | | | | | | | | |
|---------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+----|
|Комплемент розведений по |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25 |0.25|
|робочій дозі | | | | | | | | |
| |----------------------------------------------|
| |Струсити, поставити у термостат при |
| |температурі 37 град. С на 45 хвилин |
|---------------------------+----------------------------------------------|
|Гемолітична система |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |
| |----------------------------------------------|
| |Струсити, поставити у термостат при |
| |температурі 37 град. С до настання повного |
| |гемолізу в контрольній пробірці на 30-60 хв. |
|---------------------------+----------------------------------------------|
|Результат | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | - | - | - | - |
| |----------------------------------------------|
| |У даному випадку титр сироватки 1:40 |
----------------------------------------------------------------------------
Кількісне визначення реагинів має значення при оцінці
ефективності протифілітичного лікування. Швидке зниження титру
реагинів свідчить про успіх терапії. Титр реагинів, що довго не
знижується, вказує на відсутність ефективності терапії і
необхідність її зміни.
РЕАКЦІЯ ВАССЕРМАНА ЗІ СПИННОМОЗКОВОЮ РІДИНОЮ
