РЕАКЦІЯ ВАССЕРМАНА ЗІ СПИННОМОЗКОВОЮ РІДИНОЮ
Принцип. У спинномозковій рідині хворого на сифіліс можуть
бути антитіла. реагіни, здатні вступати в реакцію зв'язування
комплементу з відповідними антигенами. Реакцій ставлять з
непрогрітою спинномозковою рідиною через відсутність в ній
комплементу. Каламутну або з домішкою крові рідину центрифугують
зливають з осаду.
Спинномозкову рідину паралельно досліджують у трьох дозах:
1. Цільну.
2. Розведену ізотонічним розчином натрію хлориду 1:2.
3. Розведену ізотонічним розчином натрію хлориду 1:5.
Реакцію проводять з двома антигенами: трепонемним і
кардіоліпіновим паралельно з кожним розведенням за схемою.
Через відсутність антикомплементарних властивостей
спинномозкової рідини для дослідження комплемент в реакцій вводять
по титру (перша доза, що розчинює, без звичайної надбавки) (табл.
N 7).
ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Результати реакції враховують окремо для кожного антигену і
розведення спинномозкової рідини. Результати реакції Васермана з
спинномозковою рідиною оцінюють таким чином: повна і значна
затримка гемолізу 4+, 3+ позитивна реакція; часткова затримка
гемолізу 2+ - слабопозитивна реакція; незначна затримка гемолізу
1+ - сумнівна реакція; гемоліз - негативна реакція.
ДЖЕРЕЛА ПОМИЛОК
1. Невірний вибір дози комплементу-відсутність або надлишок
комплементу.
2. Неправильне зберігання спинномозкової рідини.
3. Тривале зберігання спинномозкової рідини.
МІКРОРЕАКЦІЯ ПРЕЦИПІТАЦІЇ З ІНАКТИВОВАНОЮ СИРОВАТКОЮ І
КАРДІОЛІПІНОВИМ АНТИГЕНОМ (ТИПУ ВДРЛ) - див. методику постановки
відбіркових мікрореакцій преципітації.
РЕАКЦІЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ НА ХОЛОДІ
Якісну реакцій для кожної досліджуваної сироватки крові
проводять у трьох пробірках з двома антигенами. Кожну інактивовану
сироватку крові, розведення 1:5 ізотонічним розчином хлориду
натрію, розливають по 0,25 мл у три пробірки: до першої додають
0,25 мл трепонемного антигену, до другої - кардіоліпіновий
антиген, Розведений за титром, до третьої контрольної - 0,25 мл
ізотонічного розчину натрію хлориду. Легким струшуванням змішують
вміст пробірок і витримують при температурі 18-20 град. С 10
хвилин. Потім в усі пробірки додають комплемент 0,25 мл, (робочу
дозу комплементу для РЗК на холоді вираховують з 50% надбавкою в
робочій дозі. одержаній під час титрування комплементу для РЗК в
умовах термостату). Міст пробірок знову струмують і разом з
гемолітичною системою ставлять у холодильник на 15-20 годин при
температурі 4 град. С.
Таблиця N 7
СХЕМИ ДОСЛІДУ РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА ЗІ СПИННОМОЗКОВОЮ РІДИНОЮ
-----------------------------------------------------------------------
|ІНГРЕДІЄНТИ (В МЛ) |NN пробірок |
| |-----------------------------------|
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
|---------------------------------+----+----+----+----+----+----+-----|
|Спинномозкова рідина |0.05|0.05|0.13|0.13|0.25|0.25|0.25 |
|---------------------------------+----+----+----+----+----+----+-----|
|Ізотонічний розчин натрію хлориду|0.2 |0.2 |0.12|0.12| - | - |0.25 |
|---------------------------------+----+----+----+----+----+----+-----|
|Антиген трепонемний, розведений |0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25| - |
|за титром | | | | | | | |
|---------------------------------+----+----+----+----+----+----+-----|
|Антиген кардіоліпіновий | - |0.25| - |0.25| - | - |0.25 |
|розведений за титром | | | | | | | |
|---------------------------------+----+----+----+----+----+----+-----|
|Комплемент, розведений за титром |0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25|0.25 |
| |-----------------------------------|
| |Струсити, поставити у термостат при|
| |температурі 37 град. С на 45 хв. |
|---------------------------------+-----------------------------------|
|Гемолітична система |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |0.5 |
| |-----------------------------------|
| |Струсити, поставити у термостат при|
| |температурі 37 град. С на 45-60 хв.|
| |(до настання гемолізу в контрольній|
| |пробірці) |
-----------------------------------------------------------------------
Наступного дня зміст пробірок і гемолітичну систему
витримують при кімнатній температурі 15 хвилин. Після чого додають
в усі пробірки по 0,5 мл гемолітичної системи, знову струшують і
вміщують у термостат при температурі 37 град. С на 45-60 хвилин.
Облік результатів реакції проводять після настання гемолізу в
контрольній пробірці досліджуваної сироватки. Ступінь затримки
гемолізу відмічають у журналі плюсами, як і під час постановки РЗК
в умовах термостату (табл. N 8).
Таблиця N 8
РЕАКЦІЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ НА ХОЛОДІ
------------------------------------------------------------------
|ІНГРЕДІЄНТИ |NN пробірок |
| |------------------------|
| | 1 | 2 | 3 |
| | | |(контр.)|
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
| 1 | 2 | 3 | 4 |
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
|Досліджувана інактивована сироватка | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
|крові, розведена 1:5 | | | |
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
|Антиген трепонемний, розведений по | 0.25 | - | - |
|титру | | | |
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
|Антиген кардіоліпіновий, розведений | - | 0.25 | 0.25 |
|по титру |------------------------|
| |Струсити, витримати |
| |10 хв. при кімнатній |
| |температурі |
|---------------------------------------+------------------------|
|Ізотонічний розчин натрію хлориду | - | - | 0.25 |
|---------------------------------------+-------+-------+--------|
|Комплемент, розведений з 50 % надбавкою| 0.25 | 0.25 | 0.25 |
|в робочій дозі | | | |
|----------------------------------------------------------------|
|Струсити, поставити на 18-20 год. у холодильник при температурі |
|4 град. С, натупного дня вміст пробірок і гемолітичної системи |
|витримувати при кімнатній температурі 15 хв. з наступною |
|інкубацією в термостаті 37 град. С 15 хв. |
|----------------------------------------------------------------|
|Гемолітична система | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
|----------------------------------------------------------------|
|Струсити, поставити на 45-60 хвилин у термостат при температурі |
| 37 град. С (до настання гемолізу в контрольних сироватках). |
------------------------------------------------------------------
Результати реакції слід давати по кожному антигену окремо.
Реакцію зв'язування комплементу на холоді рекомендують при підозрі
на сифіліс первинний серонегативний, прихований, третинний,
уроджений, а також під час атипових клінічних проявах
захворювання.
РЕАКЦІЯ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ (РІТ)
ПРИНЦИП. Реакція основана на феномені втрати блідими
трепонемами рухливості у присутності іммобілізуючих
протитрепонемних антитіл досліджуваної сироватки і комплементу в
умовах анаеробіозу.
Постановці реакції попереджує підготовча робота.
ОБРОБКА ЛАБОРАТОРНОГО ПОСУДУ
Весь лабораторний посуд (піпетки, пробірки, флакони та ін),
яки використовують для постановки реакції іммобілізації трепонем,
має бути стерильним. Перед стерилізацією його миють без
застосування дезинфікуючих засобів. Для цього після досліду
пробірки і флакони занурюють і з доданням прального порошку типу
"Лотос" у воду кімнатної температури кип'ятять протягом 40 хв.,
охолоджують до 40 градусів і миють водопровідною, спочатку теплою,
а потім холодною водою, наливаючи її у кожну пробірку 5-7 разів,
після чого один раз промивають дистильованою водою і висушують у
сушильній шафі. Висушений посуд загортають у папір і стерилізують
автоклавуванням протягом 1 години при 1,5 атмосферах. Після
стерилізації посуд знову висушують у сушильній шафі і зберігають у
шафі у боксі протягом 7 днів.
ОДЕРЖАННЯ ДОСЛІДЖУВАНОЇ СИРОВАТКИ ТА ЇЇ ОБРОБКА
Перед взяттям крові обстежуваний не повинен одержувати
медикаментами, що трепонемоцидно впливають на бліді трепонеми,
особливо препарати пеніциліну, трихопол і ін. Прийом препаратів
відміняють на строк (3-4 тижні) їхньої можливої затримки у
організмі. Під час використання пеніцилінази припинення введення
препаратів пеніциліну не обов'язкове.
Кров для реакції беруть з ліктьової вени натщесерце стерильно
у суху, хімічно чисту і стерильну пробірку. Шкіру ліктьового згину
перед прооколом протирають не спиртом, а ефіром. Взяту кров
обробляють так само, як і для реакції Вассермана, але з
дотриманням умов стерильності. В реакції використовують сироватку,
інактивовану протягом 30 хв. на водяній бані при 56 град. С. При
необхідності повторного дослідження однієї і тієї ж сироватки
інактивування проводять повторно, зле протягом 15 хвилин. Перед
дослідженням сироватку можна зберігати у холодильнику протягом
10-15 днів при температурі 10-20 град. С, а при температурі 4
град. С протягом 5 днів. Ніяких консервантів до сироватки не
додають. При необхідності транспортування стерильно зняту зі
згустку сироватку наливають в окрему ампулу, запаюють і
пересилають до лабораторії РІТ.
СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ ВИЖИВАННЯ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ
Період від моменту постановки реакції до реєстрації її
результатів триває 20 годин, тому для збереження життєздатності і
хорошої рухливості мікроорганізмів необхідне середовище
виживання. Рекомендують середовище N 2 ЦКВІ. Для приготування
середовища беруть 50 г яловичого або кролячого м'яса
відокремлюють від жиру і сухожилля, подрібнюють, заливають 100 мл
водопровідної води і ставлять у холодильник на 24 години при 4
град. С для екстрагування. Наступного дня кип'ятять протягом 10
хвилин кроляче м'ясо і 20 хвилин яловичину, охолоджують і
фільтрують через багатошаровий паперовий фільтр. Після
фільтрування установлюють РН 7,2-7.4, додаючи 20% розчину їдкого
натрію. Приготовлене середовище стерилізують автоклавуванням
протягом 30 хвилин при 2 атмосферах і ампулують. При умові
збереження стерильності середовище придатне для використання
протягом 12 місяців. Ампули з середовищем зберігають у
холодильнику при 4 град. С. Кожну нову партію середовища
попередньо порівнюють зі старою, з якою вже проводили досліди.
КОМПЛЕМЕНТ
Реакція іммобілізації протікає лише при умові надлишку
комплементу. В реакції застосовують свіжий комплемент морської
свинки. Кількість його значною мірою залежить від середовища
вживання блідих трепонем. При використанні середовища N 2 ЦКВІ в
мікроанаеростатному методі кількість комплементу становить 27 %
від загального об'єму реагентів, які використовують у реакції, а
при постановці в меланжерах 40%.
Для одержання комплементу кров беруть обов'язково у кількох
морських свинок так само, як для реакції Вассермана, але з
дотриманням умов стерилізації. Після одержання сироватки, її
наливають у стерильні пробірки по 1-4 мл і досліджують на
стерильність. Для цього 1 мл сироватки морської свинки залишають у
термостаті при 37 град. С на добу. У випадку бактеріального
забруднення комплемент бракують. щ Пробірки з комплементом
зберігають у холодильнику при -10 град. С протягом 2-3 тижнів.
Повторно заморожування і відтанення не рекомендують. Не можна
застосовувати в реакції іммобілізації блідих трепонем
консервований комплемент, оскільки він токсичний для
мікроорганізмів.
Ліофільно висушений без консерванту комплемент морської
свинки може бути використаний в реакції, але за якістю він гірший
від свіжого.
АНТИГЕН
Як антиген в реакції використовують завись блідих трепонем з
раннього орхіту кролика (7-9 доба після зараження). Використовують
бліді трепонеми штама Нікольса, які щотижнево пасерують на
кроликах. Заражених кроликів тримають у світлих приміщеннях, які
провітрюються. Годують повноцінною їжею, яка містить вітаміни
(морква обов'язкова). Для зараження слід брати здорових
кроликів-самців вагою 2,5-3 кг з негативними результатами
серологічних реакцій на сифіліс (РЗК і РІТ). За 1-2 доби до
зараження у кроликів вистригають шерсть у нижній частині живота,
внутрішній поверхні стегна і мошонки. Для одержання раннього
специфічного орхіту кролика заражують введенням у середину кожного
яєчка по 1 мл зависі блідих трепонем. У зависі повинно бути більше
500 мікроорганізмів у кожному полі зору мікроскопа при
використанні окуляра 7х і об'єктиву 40х.
Введення тваринам кортизону для придушення імуногенезу хоч і
не є суворо обов'язковим, але застосування його дозволяє збільшити
в орхіті числа блідих трепонем. Кортизон вводять внутрішньом'язово
в дозі 20 мг перед зараженням і в наступні дні по 10 мг.
З появою орхіту засвідчують збільшення розмірів яєчка і
ущільнення його. Для видалення яєчок кролика прив'язують до
станка, обезкровлюють пункцією серця, якщо кролик при цьому не
гине, його забивають повітряною емболією - введенням 20 мл повітря
у серце або вену вуха. Яєчко виводять через паховий канал в
мошонку, поглажуючи по животу від середини вниз до мошонки.
Поверхню шкіри мошонки накривають стерильною гумовою серветкою з
розрізами, через які виводять яєчка. Шкіру мошонки над яєчками
протирають тампоном, змоченим ефіром, піднімають її пінцетом
спочатку над одним яєчком і роблять розріз ножицями, через який
виводять яєчко разом з оболонкою, відрізають його біля основи
ножицями і вміщують у стерильну чашку Петрі. Далі в умовах боксу
кожне яєчко звільняють від оболонок, придатки і жиру. Вміщують у
стерильний бокс, розрізають на 10-15 частин, заливають 5 мл
ізотонічним розчином хлориду натрій і одержану завись досліджують
під мікроскопом у темному полі зору на наявність блідих трепонем.
Для цього на предметне скло пастерівською піпеткою наносять по
краплі рідини з кожного яєчка. При наявності трепонем шматочки
яєчок разом з середовищем з середовищем з бюксу переносять у
флакон місткістю 50 мл і струшують у струшувачі для вимивання
мікроорганізмів з тканини яєчок. Час струшування залежить від
числа виявлених мікроорганізмів. При наявності 5-10 блідих
трепонем у полі зору струшування триває протягом години, а при
наявності 30-40 - лише 20-30 хвилин. Після струшування зміст
флакону переносять у стерильну центрифужну пробірку і
центрифугують протягом 5 хвилин при 1000 об/хв для осідання
еритроцитів і шматочків тканини яєчок. Надсадову рідину переносять
у іншу стерильну пробірку і з неї готують препарати на предметному
склі, які досліджують у темному полі (як уже було описано),
визначаючи приблизно число блідих трепонем у кількох полях зору.
Завись блідих трепонем, яку тримають у пробірці, набирають у
шприц і заражують підготовлених кроликів, вводячи завись у
середину кожного яєчка.
Для приготування антигену завись блідих трепонем розводять
стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію так, щоб у полі
зору було 10-15 мікроорганізмів. Наприклад, якщо у зависі є
1000-1500 мікроорганізмів у кожному полі зору, тобто трепонеми
густо вкривають усе поле зору, то на 9,9 мл середовища добавляють
0,61 мл зависі трепонем, одержують розведення в 100 разів.
ГЕМОЛІТИЧНА СИСТЕМА
МЕТОДИКА ПРИГОТУВАННЯ. Дефібровану баранячу кров або
еритроцити барана в об'єкт, необхідному для роботи на даний день,
центрифугують, плазму зливають, а осад тричі відмивають 6-7
об'ємами фізіологічного розчину. Під час останнього промивання
надосадова рідина повинна бути безбарвною. З щільного осаду
готують зависі еритроцитів барана в ізотонічному розчину хлориду
натрію. Рівний об'єм гемолітичної сироватки, розведеної в
ізотонічному розчині хлориду натрію за потроєним титром,
наприклад, якщо на етикетці вказаний титр 1:1200, то для
розведення буде 1:400, тобто 0,1 мл на 40 мл фізіологічного
розчину об'єднують з 1 % зависсю еритроцитів барана. Розчин
гемолітичної сироватки приливають до зависі еритроцитів барана і
швидко змішують. Одержану гемолітичну систему витримують у
термостаті 30 хвилин при температурі 37 град. С.
ОСНОВНИЙ ДОСЛІД
Роботу по постановці реакції проводять у боксі. Кожну
сироватку досліджують у двох пробірках-дослідній і контрольній. В
обидві пробірки вносять по 0,05 мл досліджуваної сироватки і по
0,35 мл антигену. До дослідної пробірки наливають 0,15 мл
активного комплементу, а до контрольне і таку саму кількість
інактивованого комплементу. Після заповнення зміст пробірок
змішують легким струшуванням і вміщують у мікроанаеростат.
З мікроанаеростату за допомогою вакуумного насосу видаляють
атмосферне повітря і заповнюють його газовою сумішшю з балону, в
якому міститься азот (95 частин, і вуглекислий газ (5 частин). Під
час заповнення мікроанаеростатів газовою сумішшю стежать за тим,
щоб стрілка манометру не опускалася до нульового рівня. У цьому
випадку вдається уникнути підвищення тиску всередині анаеростату,
який спостерігається при переміщенні його з кімнати, де
температура 35 град. С, а також дозволяє стежити за герметичністю
цього приладу. Мікроанаеростат з пробірками вміщують у термостат
при температурі 34-35 град. С на 18-20 годин.
Під час постановки реакції використовують 5 контрольних
досліджень свідомо позитивної і негативної сироваток з
попереднього досліду, активного і інактивованого комплементу і
середовища виживання для блідих трепонем. Контрольну негативну
сироватку застосовують для висновку про ступінь рухливості блідих
трепонем у даному досліді. Контрольну позитивну сироватку для
оцінки ступеня імобілізуючої активності в умовах даного досліду.
Сироватки досліджують за вище описаною методикою. Дослідження
активного і інактивованого комплементу і середовища проводять для
ви значення їхнього впливу на рухливість блідих трепонем (табл.
N 9).
Таблиця N 9
СХЕМИ РЕАКЦІЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ
(мікроанаеростатна методика)
-----------------------------------------------------------------------
|ІНГРЕДІЕНТИ |NN пробірок |
| |---------------------------------------------|
| |1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8 |9 |
| |дос-|кон-| | | | | | | |
| |лід-|тро-| | | | | | | |
| |на |ль | | | | | | | |
|-----------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+-----|
|Досліджувана |0.05|0.05| - | - | - | - | - | - | - |
|інактивована сироватка | | | | | | | | | |
|-----------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+-----|
|Комплемент активний |0,15| - |0,15| - |0.15| - |0.15| - | - |
| | | | | | | | | | |
|-----------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+-----|
|Комплемент | - |0.15| - |0,15| - |0.15| - |0,15| - |
|інактивований | | | | | | | | | |
|-----------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+-----|
|Антиген |0.35|0,35|0.35|0,35|0,35|0.35|0,35|0.35|0.35 |
| | | | | | | | | | |
|-----------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+-----|
|Позитивна інактивована | - | - |0.35|0.35| - | - | - | - | - |
|сироватка | | | | | | | | | |
|-----------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+-----|
|Негативна інактивована | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
|сироватка | | | | | | | | | |
-----------------------------------------------------------------------
Розливання інгредієнтів під час постановки реакції проводять
у боксі, попередньо опроміненим бактерицидною кварцовою лампою
протягом 45-60 хвилин.
Оцінку одержаних результатів проводять через 18-20 годин.
Пробірки виймають з термостату і мікроанаеростату і розставляють у
штативі попарно (дослідна і контрольна). З кожної пари пробірок
пастерівською піпеткою наносять краплі на про нумероване
відповідно дослідним пробіркам предметне скло, накривають
накривним склом 20 х 20 мм і досліджують у темному полі мікроскопа
при збільшенні: об'єктив 40х, окуляр 10х. Переглядають кілька
полів зору в різних ділянках препарату, підраховуючи у кожній
число рухливих і нерухливих блідих трепонем. Підрахунок подають з
препарату з контрольної, а потім з дослідної пробірок. У препараті
підраховують не менше 25 трепонем і відмічають скільки з них
рухливих і скільки нерухливих.
Якщо у дослідному препараті міститься 13-19 рухливих блідих
трепонем, то для одержання більш достовірного результату необхідно
полічити не 25, а 50 мікроорганізмів, також відмічено серед них
число рухливих і нерухливих.
При підрахунку 50 блідих трепонем одержане число рухливих
мікроорганізмів ділять на 2.
Якщо в контрольному препараті міститься менш 17 рухливих
трепонем з 25 полічених, то такий дослід не придатний, і
дослідження даної сироватки слід повторити. У контрольних
пробірках з інактивованим комплементом відсутність рухливих
трепонем пояснюється токсичністю досліджуваної сироватки крові
частіше за все внаслідок домішок медикаментів, іноді бактеріальним
забрудненням і ін.
При визначенні рухливості блідих трепонем слід звертати увагу
на інтенсивність рухів, здійснюваних блідими трепонемами. У блідої
трепонеми не завжди можна спостерігати згинальні і контрактильні
рухи, іноді лише обертальні. Слід також уміти відрізняти активні
рухи трепонем від руху з струмом рідини.
Розрахунок проценту специфічної іммобілізації блідих трепонем
проводять за такою формулою:
А - В
X = ----- х 100,
А
де А - число рухливих блідих трепонем у контрольній пробірці,
В - число рухливих блідих трепонем у дослідній пробірці,
Х - процент іммобілізації.
24 - 21
Приклад: ------- х 100 = 12 %.
24
У практичній роботі процент іммобілізації визначають
заздалегідь складеній таблиці з застосуванням вищенаведеної
формули. Реакція іммобілізації вважається негативною, коли процент
іммобілізації коливається у межах 0-20, сумнівною від 21 до 30,
слабопозитивною - від 31 до 50 і позитивною - вище 50. Сироватки з
сумнівними і слабопозитивними реакціями потребують у повторному
дослідженні для одержання більш достовірних результатів. Доцільно
також повторювати Дослідження всіх сироваток, які дали повне
розходження результатів з результатами стандартних серологічних
реакцій. Ці сироватки заслуговують особливої уваги, оскільки в цих
випадках результати реакції іммобілізації блідих трепонем дають
можливість судити про наявність або відсутність сифілісу у
обстежуваної особи.
ВИЗНАЧЕННЯ ПРОЦЕНТУ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ
---------------------------------------------------------------------------------------------
|Кількість |Кількість рухливих трепонем у дослідних пробірках | | | |
|рухливих | | | | |
|трепонем у |---------------------------------------------------------------------+--+--+---|
|контр. |25|24 |23|22|21|20|19|18|17|16|15|14|13|12|11|10|9 |8 |7 |6 |5 |4 |3 |2 |1 |0 |
|пробірці | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-----------+--+---+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+---|
|25 |0 |4 |8 |12|16|20|24|28|32|36|40|44|48|52|56|60|64|68|72|76|80|84|88|92|96|100|
|-----------+--+---+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+---|
|24 |0 |0 |4 |8 |12|17|21|25|29|33|37|42|46|50|54|58|62|67|71|75|79|83|87|92|96|100|
|-----------+--+---+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+---|
|23 |0 |0 |0 |4 |9 |13|17|22|26|30|35|39|43|48|52|56|61|65|69|74|78|83|87|94|96|100|
|-----------+--+---+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+---|
|22 |0 |0 |0 |0 |5 |9 |14|19|23|27|32|36|41|45|50|54|59|63|68|73|77|82|86|91|95|100|
|-----------+--+---+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+---|
|21 |0 |0 |0 |0 |0 |5 |10|14|19|24|29|33|38|43|48|52|57|62|67|71|76|81|86|90|95|100|
|-----------+--+---+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+---|
|20 |0 |0 |0 |0 |0 |0 |5 |10|15|20|25|30|35|40|45|50|55|60|65|70|75|80|85|90|95|100|
|-----------+--+---+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+---|
|1З |0 |0 |0 |0 |0 |0 |0 |5 |11|16|21|26|32|37|42|47|53|56|63|68|74|79|84|89|95|100|
|-----------+--+---+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+---|
|18 |0 |0 |0 |0 |0 |0 |0 |0 |6 |11|17|22|28|35|39|44|50|56|61|67|72|78|83|89|94|100|
|-----------+--+---+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--+---|
|17 |0 |0 |0 |0 |0 |0 |0 |0 |0 |6 |12|18|24|28|35|41|47|53|59|65|71|76|82|88|94|100|
---------------------------------------------------------------------------------------------
ПРИМІТКА: Відповідь знаходять у точці перетину
горизонтального рядка з вертикальним стовпчиком, наприклад: 23
рухливі трепонеми у контрольній пробірці і 10 рухливих трепонем у
дослідній пробірці відповідають 54% іммобілізації блідих трепонем.
Визначення залишкового комплементу
Встановлення залишкового комплементу необхідно для визначення
чи достатня була кількість комплементу у дослідних пробірках, чи
не була рухливість блідих трепонем обумовлена відсутністю
комплементу, внаслідок чого іммобілізації не могли проявити свою
активність.
Після реєстрації результатів реакції іммобілізації блідих
трепонем у вмісті пробірок визначають залишковий комплемент,
додаванням до кожної пробірки гемолітичної системи в об'ємі
0,1 мл.
ДЖЕРЕЛА ПОМИЛОК
1. Токсичність досліджуваної сироватки.
2. Бактеріальне забруднення досліджуваної сироватки або
комплементу.
3. Недостатня кількість комплементу у досліді.
4. Порушення герметичності мікроанаеростату, проникнення до
нього кисню атмосферного повітря.
5. Підвищення або зниження температури у термостаті протягом
реакції.
6. Кислотність або лужність лабораторного посуду, яким
користуються під час реакції.
7. Використання медикаментів, що бактерицидно впливають на
рухливість блідих трепонем.
ДІАГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ
1. Диференціювання позитивних результатів стандартних
серологічних реакцій на сифіліс. Стандартні серологічні реакції
дають деяку кількість позитивних результатів при захворюваннях,
які не мають відношення до сифілісу. Це так звані хибнопозитивні і
неспецифічні позитивні результати. Наявність позитивних
результатів стандартних серологічних реакцій у осіб без клінічних
і анамнестичних ознак сифілісу є головним показником до постановки
реакції іммобілізації блідих трепонем. У осіб, вільних від
сифілитичної інфекції, результати реакції іммобілізації блідих
трепонем будуть негативними, тобто у сироватці таких осіб бліді
трепонеми залишаються рухливими. Реакція іммобілізації блідих
трепонем є цінним методом для розпізнавання хибнопозитивних
реакцій, особливо у вагітних і соматичних хворих. Діагноз
прихованого і невідомого сифілісу у таких осіб вимагає
обов'язкового підтвердження результатами реакції іммобілізації
блідих трепонем і реакції імунофлуоресценції (РІФ). Реакцію
іммобілізації блідих трепонем застосовують також для підтвердження
діагнозу пізніх форм сифілітичної інфекції.
Відомо, що іммобілізини з'являються у сироватці пізніше
антиліпідних і флуоресціюючих антитіл. Тому для ранньої
діагностики первинного сифілісу реакція іммобілізації блідих
трепонем непридатна. Коли є підозра на первинний сифіліс, найбільш
діагностичне цінною є реакція імунофлуоресценції.
МЕЛАНЖЕРНИЙ МЕТОД
Н.М.ОВЧИННИКОВА РЕАКЦІЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ
ПРИНЦИП. Реакція основана на феномені втрати рухливості
блідими трепонемами у присутності іммобілізинів досліджуваної
сироватки і комплементу. Анаеробні умови досліду створюються
переміщенням реагуючої суміші в меланжер (лейкоцетарний змішувач),
обидва кінці якого вкриті гумовим кільцем. Меланжерна методика
реакції дозволяє обходитись без складного обладнання та апаратури.
При порівняльному вивченні на великому клінічному матеріалі
одержано результати, які не поступаються класичній анаеростатній
методиці.
ХІД ВИЗНАЧЕННЯ
Постановці основного досліду передбачає підготовча робота,
яка складається з таких етапів:
1. Одержання і обробка досліджувані сироватки. Проводиться
так само, як і для мікроанаеростатної методики.
2. Приготування середовища для блідих трепонем. Меланжерна
методика реакції виконується з тим само середовищем що й
мікроанеростатна.
3. Комплемент. Готується і зберігається так само, як і при
мікроанаеростатній методиці.
4. Антиген. Застосовується той самий штам блідої трепонеми і
методика його приготування така ж, як і для мікроанаеростатної
методики.
5. Приготування суміші антигена з комплементом "коктейлю".
Попередньо в двох стерильних флаконах або колбах з'єднуються
комплемент з антигеном, взятих у рівних об'ємах. Кількість
комплементу і антигена залежить від загальної кількості
досліджуваних сироваток. На одну сироватку витрачають 0,15 мл
комплементу і стільки і антигену. Антиген розливають рівними
частинами в два стерильні флакони і додають до одного флакону
активний комплемент, а до другого - інактивовану сироватку
морської свинки.
6. Гемолітичну сироватку розводять так само, як для
мікроанаеростатного методу.
7. Приготування солевого розчину. Розчиняють 9.0 г хлористого
натрію хімічно чистого в 1-ому літрі дистильованої води. Розчин
фільтрують через паперовий Фільтр і стерилізують автоклавуванням
протягом 30 хв. при 2 атмосферах.
Розрахунок кількості інгредіентів для постановки реакції
іммобілізації блідих трепонем меланжерним методом.
------------------------------------------------------------------
| ІНГРЕДІЕНТИ (В МЛ) |Кількість досліджуванної сироватки |
| |-----------------------------------------|
| |1 |5 |10 |20 |30 |
|----------------------+-------+--------+-------+-------+--------|
|Флакон 1 (дослід) | | | | | |
|Антиген |0,15 |0,75 |1,5 |3,0 |4,5 |
|----------------------+-------+--------+-------+-------+--------|
|Активна сироватка |0,15 |0,75 |1,5 |3,0 |4.5 |
|морської свинки | | | | | |
|(комплемент) | | | | | |
|----------------------+-------+--------+-------+-------+--------|
|Флакон 2 (контроль) | | | | | |
|Антиген |0.15 |0,75 |1.5 |3.0 |4.5 |
|----------------------+-------+--------+-------+-------+--------|
|Інактивована сироватка|0,15 |0,75 |1.5 |3.0 |4,5 |
|морської свинки | | | | | |
|(комплемент) | | | | | |
------------------------------------------------------------------
8. Весь лабораторний посуд промивають і стерилізують так
само, як при постановці мікроанаеростатного методу. Меланжери
промивають (у рукавичках) за допомогою груші, засмоктуючи в
меланжер і вилучаючи з нього дистильовану воду двічі. Промивання
послідовне у трьох банках. Потім меланжери складають у
стерилізатор і кип'ятять протягом 30 хвилин. Воду зливають, а
меланжери переносять у сушильну шафу. Після висушування складають
у картонну коробку, загортують у папір і автоклавують так само, як
і інший скляний посуд. Після стерилізації знову висушують у
сушильній шафі і зберігають у шафі в боксі разом з іншим посудом
не більше 7 днів.
ОСНОВНИЙ ДОСЛІД
Кожну сироватку досліджують у двох меланжерах. У перший
меланжер набирають досліджувану сироватку до помітки "I". З кінця
меланжера стерильним ватним тампоном знімають залишки сироватки.
Після цього до помітки "II" набирають "коктейль" з першого
флакону. У другий меланжер набирають до помітки "I" ту саму
сироватку, а до помітки "II" - "коктейль" з другого флакону. Після
надягання кільця вміст меланжерів змішують, меланжери мітять і
укладають у спеціальний штатив або коробку з вирізами, штативи
вміщують у термостат на 18-20 годин.
При постановці меланжерного методу застосовують ті ж самі
контрольні дослідження, які використовують при мікроанаеростатному
методі.
ОЦІНКА ОДЕРЖАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ
Через 18-20 годин меланжери виймають з термостату попарно
дослідний і контрольний, і вміст їх переносять у наперед
підготовлені і пронумеровані відповідно номерам меланжерів
пробірки. Для цього після зняття кільця з поміткою меланжер
опускають у відповідну пробірку. Вміст меланжера або вільно стікає
на дно пробірки, або виштовхується з нього за допомогою гумової
піпетки, натягнутої на верхній кінець меланжера. За допомогою цієї
піпетки змішують у пробірці рідину і, не знімаючи піпетки з
верхнього кінця меланжера, нижнім його кінцем наносять краплю
рідини з дослідного меланжера на лівий бік предметного скла, а на
правий бік - краплю рідини з контрольного меланжера. Скло
попередньо нумерують відповідно до нумерації дослідних меланжерів.
Краплі накривають покривним склом, розміром 20 х 20 мм. Реєстрацію
результатів і визначення залишкового комплементу проводять так
само, як і при мікроанаеростатному методі.
Джерела помилок ті самі, що і під час застосування
мікроанаеростатної методики реакції іммобілізації блідих трепонем.
РЕАКЦІЯ ІМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦІЇ - РІФ (РІФ-АБС І РІФ-200) ДЛЯ
СПЕЦИФІЧНОЇ СЕРОДІАГНОСТИКИ СИФІЛІСУ
В останнє десятиліття велике значення для серодіагностики
прихованного сифілісу і розпізнавання неспецифічних результатів
стандартних результатів серологічних реакцій на сифіліс набрали
специфічні реакції, зокрема реакція імунофлуоресценції-РІФ
(РІФ-10, РІФ-200, РІФ-АБС). Перевагою РІФ є її більш висока
чутливість, що дозволяє використати цю модифікацію реакції для
діагностики всіх форм сифілісу, особливо розпізнавання ранніх
форм. За специфікою РІФ-АБС і РІФ-200 близькі до реакції
іммобілізації блідих трепонем. РІФ-200 і РІФ-АБС ставляться
одномоментно з однією порцією крові. РІФ-10 - при підозрі на
первинний серонегативний, уроджений, пізні форми сифілісу, під час
встановлення ретроспективне діагнозу сифілісу, після лікування.
МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РІФ
1. Досліджування сироватка крові.
Кров для одержання сироватки беруть з ліктьової вени, шкіру
над якою обробляють ефіром, в чисту і суху пробірку в об'ємі 10 мл
і обробляють так само, як для постановки реакції Вассермана.
Інактивують сироватки крові одноразово при температурі 56 град. С.
У зв'язку з тим, що РІФ ставиться не стерильно, використання
стерильного посуду і дотримання умов стерильності при зберіганні
сироваток не обов'язкове. Воно має значення лише для більш
тривалого зберігання сироваток крові до дослідження.
2. Антиген.
Як антиген використовують завись патогенних блідих трепонем
штаму Нікольса 7-добового орхіту кролика. Здорових кроликів-самців
з негативними результатами реакції Вассермана і РІТ заражають
інтратестикулярно 0,75 - 1,0 мл зависі, густота якої відповідає
40-60 трепонемам у темному полі зору. На 7 добу після зараження
кроликів знекровлюють, забивають повітряною емболією і вилучають у
них обидва яєчка. Яєчка очищають від жиру, від оболонок,
придатків, розрізують на 10-15 кусочків, заливають у колбі 5-10-15
мл стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду (РН-7,2 - 7,4)
і струшують 50-60 хв. Одержану завись блідих трепонем зливають з
кусочків яєчок у стерильні пробірки з ватними пробками і залишають
у холодильнику при 4-8 град. С на добу, після чого відокремлюють
від осаду і при тих самих умовах зберігають весь період
використання.
Одержання і зберігання антигену вимагає дотримання умов
стерильності, оскільки з одним і тим самим антигеном реакція може
ставитися протягом 2-4 місяців. Для антигена слід вибирати ту
завись, в якій не спостерігається аглютинації трепонем і є
достатня їх кількість. Антиген може бути одержаний в ампулах з
інших лабораторій. Перед кожною постановою реакції завись добре
перемішують і досліджують у темному полі зору для визначення її
густоти.
При вживанні сухого трепонемного антигена - в ампулу з сухим
антигеном добавляють 0,5 мл або 1,0 мл фосфатного буферу
(РН 7,2-7,4) і розчиняють 15-20 хвилин. Використовують також, як і
нативний антиген.
3. РІФ-АБС. Сорбент.
Як сорбент для РІФ-АБС може бути використаний ультразвуковий
трепонемний антиген для РЗК, який випускає Каунаське підприємство
по виробництву бактерійних препаратів Міністерства охорони
здоров'я Литви. Він є сонікатом, оскільки являє собою розріджену
ультразвуком завись суміші культуральних блідих трепонем V, VII,
VIII, IX і Рейтера штамів.
Кожна серія сорбенту перед використанням у РІФ-АБС з
діагностичною метою має бути відтитрованою.
ТИТРУВАННЯ СОРБЕНТІВ
Сорбенти титрують на сироватках крові хворих на сифіліс, які
дають у РІФ позитивний (4+, 3+), слабопозитивний (2+) результат у
розведенні 1:5, на сироватках крові, які дають у РІФ-5
неспецифічну позитивність (2+ і більше), а також на сироватках
крові вільних від сифілітичної інфекції.
ПРИКЛАД ВИЗНАЧЕННЯ ТИТРУ СОРБЕНТУ
Нерозведений сорбент розчиняють фосфатним буфером (РН
7,2-7,4) в 2,3,4, рази і більше. Беруть три сироватки крові хворих
на сифіліс, одна з яких дає в РІФ позитивний (4+) результат,
2-слабопозитивний (2+) результат і 5 сироваток крові від людей,
вільних від сифілітичної інфекції, які в тому числі які дають
неспецифічні результати (2+ і більше). Сироватки крові розводять
сорбентом, розведеденим у 2, 3, 4 - і більше разів і випробовують
у РІФ. Контролем у даному досліді є ті самі сироватки крові,
розведені у 5 разів не сорбентом, а фосфатним буфером.
Титром сорбенту в даному випадку було розведення 1:3, під час
якого всі сироватки крові хворих на сифіліс зберігали ступінь
позитивності, одержаний у контролі, і в той же час надійно
знімалась неспецифічна позитивність несифілітичних сироваток
крові.
РЕЗУЛЬТАТИ ТИТРУВАННЯ СОРБЕНТУ
------------------------------------------------------------------
|Досліджувана |Результати РІФ-5 |
|сироватка крові |-------------------------------------------|
| |Розведення |Розведення сироваток крові 1:5 |
| |сироваток |сорбентом у розведенні |
| |крові 1:5 |-------------------------------|
| |буфером (К)| 1:2 | 1:3 | 1:4 |
|--------------------+-----------+---------+---------+-----------|
|Сироватка крові |4+ |3+ |4+ |4+ |
|хворого на сифіліс | | | | |
|N 1 | | | | |
|--------------------+-----------+---------+---------+-----------|
